HPLC

PENDAHULUAN

Dalam analisis bahan digunakan metode HPLC (kromatografi cair kinerja tinggi) pada makalah  ini melihat bagaimana itu dilakukan dan menunjukkan bagaimana menggunakan prinsip kerja suatu analisis kuantitatif pada kandungan bahan yang akan diuji seperti pada kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom yang akan dibahas lebih lanjut sebagai berikut.

Dalam HPLC sendiri terdapat berbagai macam fase  dimana tiap fase memiliki perbedaan serta tujuan dari pembagian tiap fase tersebut seperti fase normal dan fase terbalik. Pada makalah ini juga dibahas tentang bagaimana proses dari sistim kerja HPLC serta beberapa factor pengaruh yang mempengaruhi kerja dari sistim operasi dari metode HPLC ini.

. Kromatografi cair kinerja tinggi pada dasarnya adalah sebuah bentuk yang sangat baik dari kromatografi kolom.. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atmosfer. Itu membuat lebih cepat.

Hal ini juga memungkinkan untuk menggunakan ukuran partikel yang sangat jauh lebih kecil untuk bahan kemasan kolom yang memberikan luas permukaan yang jauh lebih besar untuk interaksi antara fase diam dan molekul-molekul yang mengalir melewatinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen campuran.

Perbaikan utama lain atas keprihatinan kromatografi kolom metode pendeteksian yang dapat digunakan. These methods are highly automated and extremely sensitive. Metode ini sangat otomatis dan sangat sensitif.

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI - HPLC

Kromatografi cair kinerja tinggi adalah alat yang ampuh dalam analisis. Halaman ini melihat bagaimana itu dilakukan dan menunjukkan bagaimana menggunakan prinsip yang sama seperti pada kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom.

kromatografi teknik yang dapat memisahkan campuran senyawa dan digunakan dalam biokimia dan kimia analitik untuk mengidentifikasi, mengukur dan memurnikan masing-masing komponen campuran.

HPLC biasanya menggunakan berbagai jenis fasa diam, sebuah pompa yang bergerak fase mobile (s) dan analit melalui kolom, dan detektor yang menyediakan waktu retensi karakteristik untuk analit. Detektor dapat juga memberikan informasi karakteristik lainnya (yaitu UV / Vis data spektroskopi untuk analit jika demikian dilengkapi waktu retensi analit bervariasi tergantung pada kekuatan interaksi dengan fase diam, rasio / komposisi pelarut (s) yang digunakan, dan laju alir fase gerak.

Dengan HPLC, pompa (bukan gravitasi) memberikan tekanan yang lebih tinggi diperlukan untuk menggerakkan fase gerak dan analit melalui kolom padat. Kepadatan meningkat timbul dari ukuran partikel yang lebih kecil. Hal ini memungkinkan untuk pemisahan yang lebih baik pada kolom panjang lebih pendek bila dibandingkan dengan kromatografi kolom biasa

Kolom dan pelarut

Membingungkan, ada dua perbedaan dalam HPLC tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam.

Operasi

sampel yang akan dianalisis diperkenalkan dalam volume kecil untuk aliran fase gerak. Gerakan solusi melalui kolom diperlambat oleh kimia tertentu atau interaksi fisik dengan fase diam yang hadir di dalam kolom. Kecepatan bergerak solusi tergantung pada sifat sampel dan pada komposisi dari fase (kolom) stasioner. Waktu di mana suatu elutes sampel tertentu (yang keluar dari ujung kolom) disebut waktu retensi, waktu retensi dalam kondisi tertentu dianggap sebagai karakteristik mengidentifikasi sampel yang diberikan. Penggunaan kolom ukuran partikel kemasan lebih kecil (yang menciptakan backpressure lebih tinggi) meningkatkan linear kecepatan memberikan komponen lebih sedikit waktu untuk menyebar di dalam kolom, meningkatkan kromatogram resolusi. Umum pelarut digunakan termasuk kombinasi larut dalam air atau cairan berbagai organik (yang paling umum adalah metanol dan asetonitril.  Air mungkin mengandung buffer atau garam untuk membantu dalam pemisahan komponen sampel, atau senyawa, seperti asam trifluoroacetic yang bertindak sebagai agen pasangan ion.

Sebuah perbaikan lebih lanjut HPLC adalah memvariasikan komposisi fase gerak selama analisis tersebut; elusi gradient. Sebuah gradien normal untuk kromatografi fase terbalik mungkin mulai di% metanol 5 dan kemajuan linear menjadi metanol 50% lebih dari 25 menit; gradien tergantung pada seberapa hidrofobik sampel. gradien memisahkan campuran sampel sebagai fungsi dari afinitas. Proses partisi ini mirip dengan yang terjadi selama ekstraksi cair-cair tetapi terus menerus, tidak langkah-bijaksana. Dalam contoh ini, dengan menggunakan air / gradien metanol, komponen hidrofobik lebih akan mengelusi (datang dari kolom) ketika fase gerak terdiri sebagian besar dari metanol (memberikan mobile fase hidrofobik relatif).

Pemilihan pelarut, aditif dan gradien tergantung pada sifat dari kolom dan sampel. Seringkali serangkaian tes yang dilakukan pada sampel bersama-sama dengan sejumlah uji coba untuk menemukan metode KCKT yang memberikan pemisahan puncak terbaik.

Sebuah HPLC terkandung modern sendiri. Dalam gambar ini, sebuah Agilent 1200 terhubung ke PC.

skromatografi partisi adalah jenis pertama dari kromatografi yang dikembangkan kimiawan. The koefisien partisi Prinsip telah diterapkan di kromatografi kertas , kromatografi lapis tipis , fasa gas -cair dan aplikasi cair. Tahun 1952 Hadiah Nobel di bidang kimia telah diperoleh oleh Archer John Porter Martin dan Richard Laurence Millington Synge bagi perkembangan mereka dari teknik, yang digunakan untuk pemisahan mereka dari asam amino  kromatografi partisi menggunakan pelarut dipertahankan, di permukaan atau di dalam biji-bijian atau serat dari sebuah "inert" solid matrik pendukung seperti kromatografi kertas , atau mengambil keuntungan dari beberapa tambahan muatan dan / atau hidrogen donor interaksi dengan dukungan solid. Molekul menyetimbangkan (partisi) antara fase diam cair dan eluen. Dikenal sebagai Hidrofilik Interaksi Kromatografi (HILIC) dalam HPLC, metode ini memisahkan analit berdasarkan perbedaan kutub HILIC paling sering menggunakan kutub terikat fase diam dan-polar, air yang tidak larut , fase gerak HPLC partisi telah digunakan historis pada silika tak terikat atau mendukung alumina. Masing-masing bekerja secara efektif untuk memisahkan analit oleh perbedaan kutub relatif, bagaimanapun, HILIC memiliki keuntungan dari memisahkan asam , dasar netral zat terlarut dan dalam kromatogram tunggal.

The polar analit berdifusi ke lapisan air yang diam yang terkait dengan fase diam polar dan karena itu ditahan. Retensi kekuatan meningkat dengan polaritas analit meningkat, dan interaksi antara analit kutub dan fase diam polar (relatif terhadap fase gerak) meningkatkan waktu elusi. Kekuatan interaksi tergantung pada kelompok-kelompok fungsional dalam molekul analit yang mempromosikan partisi tetapi juga dapat mencakup muatan (elektrostatik) interaksi dan donor kemampuan hidrogen.
Penggunaan pelarut polar lebih dalam fase gerak akan menurunkan waktu retensi dari analit, sedangkan hidrofobik pelarut lebih cenderung meningkatkan waktu retensi.

Fase normal HPLC

Ini pada dasarnya adalah sama seperti apa yang sudah anda baca tentang kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Meskipun disebut sebagai "normal", ini bukan bentuk yang paling umum digunakan HPLC.

Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non-polar - heksana, misalnya. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari itu), dan panjang 150 sampai 250 mm.

Polar senyawa dalam campuran yang sedang melewati kolom akan melekat lebih lama untuk silika polar daripada senyawa non-polar akan. Yang non-polar sehingga akan lebih cepat melewati kolom.

Juga dikenal sebagai fase normal HPLC (NP-HPLC), atau kromatografi adsorpsi, metode ini memisahkan analit berdasarkan adsorpsi ke kimia permukaan stasioner dan polaritas itu adalah salah satu jenis pertama KCKT yang dikembangkan kimiawan. NP-HPLC menggunakan fasa diam polar dan fase, non-polar mobile non-air, dan bekerja efektif untuk memisahkan analit mudah larut dalam pelarut non-polar. Perusahaan asosiasi analit dengan dan dipertahankan oleh fase diam polar. Adsorpsi kekuatan meningkat dengan polaritas analit meningkat, dan interaksi antara analit kutub dan fase diam polar (relatif terhadap fase gerak) meningkatkan waktu elusi. Kekuatan interaksi tidak hanya tergantung pada kelompok-kelompok fungsional dalam molekul analit, tetapi juga pada faktor-faktor sterik. Pengaruh sterics pada kekuatan interaksi memungkinkan metode ini untuk menyelesaikan (terpisah) isomer struktural .

Penggunaan pelarut polar lebih dalam fase gerak akan menurunkan waktu retensi dari analit, sedangkan pelarut lebih hidrofobik cenderung meningkat kali retensi. Sangat pelarut polar dalam campuran yang cenderung menonaktifkan fase diam dengan membuat lapisan air yang diam terikat pada permukaan fase diam. Perilaku ini agak aneh bagi fasa normal karena sangat murni mekanisme serap (interaksi adalah dengan permukaan yang keras daripada lapisan lembut pada permukaan).

Partisi dan NP-HPLC jatuh dari kasih karunia di tahun 1970-an dengan perkembangan terbalik-fase HPLC karena kurangnya reproduksibilitas kali retensi sebagai air atau pelarut organik protik mengubah keadaan hidrasi silika atau alumina media kromatografi. Baru-baru ini telah menjadi berguna lagi dengan perkembangan HILIC fase terikat yang meningkatkan reproduktifitas.

HPLC Fase Terbalik

Dalam hal ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi untuk membuat non-polar dengan melampirkan rantai hidrokarbon panjang untuk permukaan - biasanya dengan atom karbon, baik 8 atau 18 di dalamnya. Sebuah pelarut polar digunakan - misalnya, campuran air dan alkohol seperti metanol.

Dalam hal ini, akan ada daya tarik yang kuat antara molekul pelarut dan polar polar dalam campuran yang sedang melewati kolom. Tidak akan ada sebagai daya tarik jauh antara rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul polar dalam larutan. Molekul polar dalam campuran itu akan menghabiskan sebagian besar waktu mereka bergerak dengan pelarut.

Senyawa non-polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena gaya dispersi van der Waals. Mereka juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya di antara molekul-molekul air atau metanol, misalnya. Oleh karena itu mereka menghabiskan lebih sedikit waktu dalam larutan dalam pelarut dan ini akan memperlambat mereka dalam perjalanan mereka melalui kolom. Itu berarti bahwa molekul polar yang akan melakukan perjalanan melalui kolom lebih cepat. Fase terbalik HPLC adalah bentuk yang paling umum digunakan HPLC.

tahap kromatografi Terbalik (RPC)

Sebuah kromatogram dari campuran kompleks yang diperoleh HPLC fasa terbalik

Untuk lebih lanjut, lihat -fase kromatografi Terbalik .

HPLC fasa terbalik (RP-HPLC atau RPC) memiliki fase stasioner non-polar dan fase, air bergerak agak polar. Satu fase stasioner umum adalah silika yang telah diobati dengan RME ₂ SiCl, dimana R adalah gugus alkil rantai lurus seperti C ₁₈ H ₃₇ atau C ₈ H _17. Dengan fasa diam, waktu retensi lebih lama bagi molekul yang lebih non-polar, sedangkan molekul polar mengelusi lebih mudah. Seorang penyidik dapat meningkatkan waktu retensi dengan menambahkan lebih banyak air ke fase bergerak; sehingga membuat afinitas dari analit hidrofobik untuk fase diam hidrofobik kuat relatif terhadap fase bergerak lebih hidrofilik. Demikian pula, seorang penyelidik dapat menurunkan waktu retensi dengan menambahkan lebih pelarut organik eluen. RPC sangat umum digunakan sehingga sering salah disebut sebagai "HPLC" tanpa spesifikasi lebih lanjut.

RPC beroperasi pada prinsip kekuatan hidrofobik, yang berasal dari simetri tinggi dalam struktur air dipole dan memainkan peran paling penting dalam semua proses dalam ilmu kehidupan. RPC memungkinkan pengukuran gaya-gaya interaktif. Pengikatan analit ke fase stasioner sebanding dengan luas permukaan kontak sekitar segmen non-polar dari molekul analit pada asosiasi dengan ligan dalam eluen air. Ini solvophobic efek didominasi oleh kekuatan air untuk "pengurangan rongga-" sekitar analit dan C _18-rantai versus kompleks keduanya. Energi yang dilepaskan dalam proses ini adalah sebanding dengan tegangan permukaan dari eluen (air: 7,3 × 10 ^-6 J / cm ², metanol: 2,2 × 10 ^-6 J / cm ²) dan permukaan hidrofobik dari analit dan ligan masing-masing . Retensi ini dapat dikurangi dengan menambahkan sedikit pelarut polar (metanol, asetonitril ) ke dalam fase gerak untuk mengurangi tegangan permukaan air. elusi Gradient menggunakan efek ini dengan secara otomatis mengurangi polaritas dan tegangan permukaan fase gerak air selama kursus analisis.

sifat struktur pada molekul analit memainkan peran penting dalam karakteristik retensi. Secara umum, sebuah analit dengan luas permukaan yang lebih besar hidrofobik (CH, CC, dan obligasi atom umumnya non-polar, seperti SS dan lain-lain) hasil dalam waktu retensi lebih lama karena meningkatkan permukaan non-polar molekul's area, yang tidak -berinteraksi dengan struktur air. Di sisi lain, kelompok polar, seperti-OH,-NH _2, COO ^- atau-NH ₃ ⁺ mengurangi retensi seperti yang terintegrasi dengan baik ke dalam air. Sangat molekul besar, bagaimanapun, dapat mengakibatkan interaksi yang tidak lengkap antara permukaan analit besar dan rantai alkil ligan dan dapat memiliki masalah pori-pori memasuki fase diam.

Retensi waktu meningkat dengan hidrofobik (non-polar) luas permukaan. Senyawa rantai Branched mengelusi lebih cepat dari isomer yang berhubungan linear karena luas permukaan keseluruhan menurun. Demikian pula senyawa organik dengan satu obligasi CC mengelusi kemudian dibandingkan dengan C = C atau ikatan CC-tiga, sebagai ikatan ganda atau tiga lebih pendek dari ikatan-CC tunggal.

Selain dari fase tegangan permukaan mobile (kekuatan organisasi dalam struktur eluen), lain pengubah fase gerak dapat mempengaruhi retensi analitik. Misalnya, penambahan garam anorganik menyebabkan kenaikan linier moderat dalam tegangan permukaan larutan mengandung air (sekitar 1,5 × 10 ^-7 J ² cm / per Mol untuk NaCl, 2,5 × 10 ^-7 J ² cm / per Mol untuk (NH ₄ ) ₂ SO _4), dan karena entropi dari-pelarut antarmuka analit dikendalikan oleh tegangan permukaan, penambahan garam cenderung meningkatkan waktu retensi. Teknik ini digunakan untuk pemisahan ringan dan pemulihan protein dan perlindungan dari kegiatan biologis mereka dalam analisis protein (kromatografi interaksi hidrofobik, HIC).

Komponen penting lainnya adalah pengaruh pH karena ini dapat mengubah sifat hidrofobik analit. Untuk alasan ini metode yang paling menggunakan agen buffering , seperti natrium fosfat , untuk mengendalikan pH. Buffer melayani beberapa tujuan: mereka kontrol pH, menetralkan muatan pada setiap terpapar silika residual pada fase diam dan bertindak sebagai agen pasangan ion untuk menetralkan muatan analit. formate Amonium biasanya ditambahkan dalam spektrometri massa untuk meningkatkan deteksi analit tertentu dengan pembentukan amonium aduk . Suatu asam organik yang mudah menguap seperti asam asetat , atau paling sering asam format , sering ditambahkan ke fase mobile jika spektrometri massa digunakan untuk menganalisis kolom eluen. Trifluoroacetic asam yang jarang digunakan dalam aplikasi spektrometri massa karena kegigihan dalam detektor dan sistem pengiriman pelarut, tetapi dapat secara efektif meningkatkan retensi analit seperti asam karboksilat dalam aplikasi menggunakan detektor lainnya, karena merupakan salah satu asam organik kuat. Pengaruh asam dan buffer berbeda-beda oleh aplikasi namun pada umumnya meningkatkan kromatografi.

Kolom fase Terbalik cukup sulit untuk kerusakan dibandingkan dengan kolom silika normal, namun banyak kolom fase balik terdiri dari alkil partikel silika diderivatisasi dan tidak boleh digunakan dengan air basis karena ini akan menghancurkan partikel silika yang mendasarinya. dari peralatan HPLC. RP-HPLC Kolom ini harus dibilas dengan pelarut bersih setelah digunakan untuk membuang asam sisa atau buffer, dan disimpan dalam komposisi yang sesuai pelarut. Kandungan logam dari kolom HPLC harus disimpan rendah jika kemampuan terbaik untuk zat yang terpisah harus ditahan. Sebuah tes yang baik untuk kandungan logam kolom adalah untuk menyuntikkan sampel yang merupakan campuran dari 2,2 '- dan 4,4' - bipiridin. Karena 2,2 '-bipy bisa chelate logam, bentuk dari puncak untuk 2,2 '-bipy akan terdistorsi (tailed) ketika logam ion yang hadir pada permukaan silika.

Pemindahan kromatografi

Prinsip dasar kromatografi perpindahan adalah: molekul dengan tinggi untuk afinitas kromatografi matriks (yang) displacer akan bersaing secara efektif untuk mengikat, situs dan dengan demikian menggantikan semua molekul dengan lebih rendah. kedekatan A  ada perbedaan jelas antara perpindahan dan kromatografi elusi . Dalam mode elusi, zat biasanya muncul dari sebuah kolom dalam sempit, puncak Gaussian. Wide pemisahan puncak, sebaiknya data dasar, yang diinginkan untuk mencapai pemurnian maksimal. Kecepatan di mana setiap komponen campuran bergerak ke bawah kolom dalam modus elusi tergantung pada banyak factor. Tapi untuk dua zat untuk bepergian dengan kecepatan yang berbeda, dan dengan demikian dapat diselesaikan, harus ada perbedaan substansial dalam beberapa interaksi antara biomolekul dan matriks kromatografi. parameter operasi disesuaikan untuk memaksimalkan pengaruh dari perbedaan ini. Dalam banyak kasus, dasar pemisahan puncak dapat dicapai hanya dengan elusi gradien dan beban kolom rendah.  Jadi, dua kelemahan untuk kromatografi elusi mode, terutama pada skala preparatif, kompleksitas operasional, karena gradien memompa pelarut, dan throughput yang rendah, karena beban kolom rendah. Kromatografi Pemindahan memiliki keunggulan dibandingkan kromatografi elusi dalam komponen diselesaikan dalam zona berturut-turut zat murni bukan "puncak. Karena proses mengambil keuntungan dari nonlinier dari isoterm, feed kolom yang lebih besar dapat dipisahkan pada kolom yang diberikan dengan komponen dimurnikan pulih pada konsentrasi yang lebih tinggi secara signifikan.

Melihat seluruh proses

Skema aliran HPLC

 Injeksi sampel

Injeksi sample seluruhnya otomatis, dan Anda tidak akan diharapkan untuk mengetahui bagaimana hal ini dilakukan pada tingkat dasar. Karena tekanan yang terlibat, itu tidak sama seperti pada kromatografi gas (jika anda telah mempelajari itu).

Waktu retensi

Waktu yang dibutuhkan untuk suatu senyawa tertentu untuk melakukan perjalanan melalui kolom untuk detektor disebut sebagai waktu retensi. Kali ini diukur dari waktu dimana sampel diinjeksikan ke titik di mana layar menunjukkan ketinggian puncak maksimum untuk senyawa tersebut.

Senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda pula. Untuk senyawa tertentu, waktu retensi akan bervariasi tergantung pada beberapa hal berikut ini:

• tekanan yang digunakan (karena yang mempengaruhi laju alir pelarut)
• sifat fase diam (tidak hanya apa bahan itu terbuat dari apa, tetapi juga ukuran partikel)
• komposisi yang tepat dari pelarut
• suhu kolom

dengan mengetahui pengaruh tersebut berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati jika  menggunakan waktu retensi sebagai cara untuk mengidentifikasi senyawa.

Detektor

Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Sebuah metode umum yang mudah untuk menjelaskan menggunakan penyerapan ultra-violet.

Banyak senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang jika Anda memiliki seberkas sinar UV bersinar melalui aliran cairan yang keluar dari kolom, dan detektor UV di seberang sungai, Anda bisa mendapatkan pembacaan langsung berapa banyak cahaya yang diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan tergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati balok pada saat itu.

Anda mungkin heran mengapa pelarut yang digunakan tidak menyerap sinar UV. Tapi senyawa yang berbeda menyerap paling kuat di berbagai bagian dari spektrum UV.

Metanol, misalnya, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm, dan air di bawah 190 nm. Jika menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, karena itu harus menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.

Menafsirkan output dari detektor

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak - masing-masing mewakili satu senyawa dalam campuran melewati detektor dan menyerap sinar UV. Selama dilakukan dengan hati-hati untuk mengontrol kondisi kolom, dapat digunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa ini - yang disediakan telah diukur  untuk contoh murni dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Tapi juga dapat menggunakan puncak sebagai cara untuk mengukur jumlah dari senyawa ini. Diasumsikan bahwa tertarik dalam dalam memgamati senyawa tertentu, X. Jika melakukan menginjeksi suatu larutan yang mengandung sejumlah dikenal X murni ke dalam mesin, tidak hanya bisa  merekam waktu retensi, tetapi juga bisa berhubungan jumlah X ke puncak yang terbentuk.

Area dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang telah melewati detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis oleh komputer yang terhubung ke layar. Daerah itu akan mengukur ditunjukkan dalam warna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang - meskipun waktu retensi akan tetap sama. Sebagai contoh:

Ini berarti bahwa  mungkin untuk mengkalibrasi mesin sehingga dapat digunakan untuk mengetahui berapa banyak zat hadir - bahkan dalam jumlah yang sangat kecil.

Jika yang diamati dua zat yang berbeda dalam campuran (X dan Y)

Coupling HPLC pada spektrometer massa

Ketika detektor menunjukkan puncak, beberapa dari apa yang melewati detektor pada waktu itu dapat Dalam diagram, daerah di bawah puncak Y lebih kecil daripada untuk X. Itu mungkin karena ada Y kurang dari X, tetapi bisa juga terjadi karena Y menyerap sinar UV pada panjang gelombang yang anda gunakan tidak kurang dari X . Mungkin ada jumlah besar Y yang hadir, tetapi jika hanya diserap lemah, itu hanya akan memberikan puncak kecil.

dialihkan pada spektrometer massa. Dimana akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan terhadap database komputer pola yang dikenal. Itu berarti bahwa

identitas sejumlah besar senyawa dapat ditemukan tanpa harus mengetahui waktu retensi dari bahan tersebut.

pengecualian kromatografi Ukuran

Ukuran-kromatografi eksklusi (SEC), juga dikenal sebagai permeasi kromatografi gel atau kromatografi filtrasi gel, memisahkan partikel berdasarkan ukuran. Ini besar seperti protein atau polimer. SEC bekerja dengan menjebak molekul-molekul yang lebih kecil di umumnya merupakan kromatografi resolusi rendah sehingga sering dicadangkan untuk, akhir langkah "polishing" dari suatu pemurnian. Hal ini juga berguna untuk menentukan struktur tersier dan struktur kuartener protein dimurnikan. SEC digunakan terutama untuk analisis molekul pori-pori partikel. Molekul-molekul yang lebih besar hanya melewati pori-pori karena mereka terlalu besar untuk masuk ke pori-pori.. Oleh karena itu molekul yang lebih besar mengalir melalui kolom lebih cepat dari molekul yang lebih kecil, yaitu semakin kecil molekul, semakin lama waktu retensi.

Teknik ini banyak digunakan untuk penentuan berat molekul polisakarida. SEC adalah teknik resmi (disarankan oleh Pharmacopeia Eropa) untuk perbandingan berat molekul yang berbeda tersedia secara komersial-molekul berat rendah heparins .

Ion kromatografi pertukaran

Dalam kromatografi pertukaran ion, retensi didasarkan pada daya tarik antara ion terlarut dan situs dibebankan terikat pada fase diam. Dari biaya yang sama tidak termasuk. Jenis penukar ion antara lain:

• Resin Polistirena - Ini memungkinkan hubungan lintas yang meningkatkan stabilitas dari rantai. Linkage Tinggi lintas mengurangi swerving, yang meningkatkan waktu equilibrium dan akhirnya meningkatkan selektivitas.
• Selulosa dan dekstran penukar ion (gel) - ini memiliki ukuran pori yang lebih besar dan kepadatan biaya rendah membuat mereka cocok untuk pemisahan protein.
• Terkendali-pori kaca atau silika berpori

Secara umum, penukar ion mendukung pengikatan ion biaya yang lebih tinggi dan radius yang lebih kecil.

Peningkatan ion counter (berkenaan dengan kelompok-kelompok fungsional dalam resin) mengurangi konsentrasi waktu retensi. Peningkatan pH mengurangi waktu retensi dalam pertukaran kation sedangkan penurunan pH mengurangi waktu retensi dalam pertukaran anion.

Bentuk kromatografi secara luas digunakan dalam aplikasi berikut: air pemurnian, prakonsentrasi jejak komponen, pertukaran ligan-kromatografi, pertukaran ion kromatografi protein, tinggi pH kromatografi pertukaran anion karbohidrat dan oligosakarida, dan lain-lain.

kromatografi Bioaffinity

Proses kromatografi bergantung pada properti dari bahan biologis aktif untuk membentuk kompleks stabil, spesifik, dan reversibel. Pembentukan kompleks ini melibatkan partisipasi pasukan molekul umum seperti Van der Waals interaksi, interaksi elektrostatik, interaksi dipol-dipol, interaksi hidrofobik, dan ikatan hidrogen. complementary binding sites. Ikatan, efisien biospecific dibentuk oleh tindakan simultan dan terpadu dari beberapa gaya-gaya dalam situs pengikatan pelengkap.

Normal-tahap kromatografi berair

Berair kromatografi fase normal (ANP) adalah suatu teknik kromatografi yang meliputi wilayah fase gerak antara kromatografi fase terbalik (RP) dan organik kromatografi fasa normal (ONP). Teknik ini digunakan untuk mencapai selektivitas unik untuk senyawa hidrofil, elusi menunjukkan fase-fase normal yang menggunakan pelarut terbalik.

Aliran isokratik dan elusi gradien

Sebuah pemisahan dimana komposisi fase gerak tetap konstan selama prosedur ini disebut isokratik (makna komposisi konstan). Kata ini diciptakan oleh Csaba Horvath yang merupakan salah satu pelopor HPLC.

Sebuah pemisahan dimana komposisi fase gerak berubah selama proses pemisahan digambarkan sebagai elusi gradien. Salah satu contoh adalah gradien mulai 10% metanol dan berakhir di 90 metanol% setelah 20 menit. Dua komponen dari fase gerak biasanya disebut "A" dan "B"; A adalah "lemah" pelarut yang memungkinkan terlarut ke mengelusi hanya perlahan-lahan, sedangkan B adalah "kuat" pelarut yang cepat elutes yang zat terlarut dari kolom . Pelarut adalah sering air, sedangkan B adalah larut pelarut organik dengan air, seperti asetonitril, metanol, THF , atau isopropanol.

Dalam elusi isokratik, meningkat lebar puncak dengan waktu retensi linear menurut persamaan untuk N, jumlah pelat teoritis. Hal ini menyebabkan kelemahan yang memuncak akhir-eluting menjadi sangat datar dan luas.. bentuk mereka dan lebar bisa mencegah mereka diakui sebagai puncak.

Elusi Gradient menurunkan retensi komponen nanti-eluting sehingga mereka mengelusi cepat, memberikan sempit (dan lebih tinggi) untuk komponen yang paling puncak. Hal ini juga meningkatkan bentuk puncak puncak tailed, sebagai peningkatan konsentrasi eluen organik mendorong bagian tailing dari puncak ke depan. Hal ini juga meningkatkan tinggi puncak (puncak tampak "lebih tajam"), yang penting dalam analisis jejak. Program gradien mungkin termasuk tiba-tiba "langkah" peningkatan persentase komponen organik, atau lereng yang berbeda pada waktu yang berbeda - semua sesuai dengan keinginan untuk pemisahan optimal dalam waktu minimum.

Dalam elusi isokratik, selektivitas tidak berubah jika dimensi kolom (panjang dan diameter bagian dalam) perubahan - yaitu, puncak mengelusi dalam urutan yang sama. Dalam elusi gradien, urutan elusi dapat berubah sebagai dimensi atau tingkat perubahan aliran.

Kekuatan pendorong dalam kromatografi fase terbalik berasal dalam urutan tinggi struktur air. Peran komponen organik dari fase gerak adalah untuk mengurangi urutan tinggi dan dengan demikian mengurangi kekuatan penghambat dari komponen air.

Parameter

Diameter Internal

Diameter internal (ID) dari sebuah kolom HPLC merupakan parameter penting yang mempengaruhi sensitivitas deteksi dan selektivitas pemisahan di elusi gradien. Hal ini juga menentukan jumlah analit yang dapat dimuat ke kolom. Kolom yang lebih besar biasanya terlihat dalam aplikasi industri, seperti pemurnian produk obat untuk digunakan kemudian. Rendah-ID kolom telah meningkatkan kepekaan dan konsumsi pelarut lebih rendah dengan mengorbankan kapasitas beban.

• ID kolom yang lebih besar (lebih dari 10 mm) digunakan untuk memurnikan jumlah yang dapat digunakan bahan karena kapasitas muat besar mereka.
• Kolom analisis skala (4,6 mm) telah menjadi jenis yang paling umum kolom, meskipun kolom kecil dengan cepat mendapatkan popularitas. Mereka digunakan dalam analisis kuantitatif tradisional sampel dan sering menggunakan detektor-Vis absorbansi UV .
• Sempit menanggung kolom (1-2 mm) digunakan untuk aplikasi ketika sensitivitas lebih diinginkan baik dengan khusus-vis detektor UV, fluoresensi deteksi atau dengan metode pendeteksian lainnya seperti spektrometri massa-kromatografi cair
• Kolom kapiler (di bawah 0,3 mm) digunakan hampir secara eksklusif dengan deteksi alternatif cara seperti spektrometri massa. Biasanya biasanya terbuat dari leburan silika kapiler, bukan stainless steel tubing yang mempekerjakan lebih besar kolom.

Ukuran butiran

Kebanyakan HPLC tradisional dilakukan dengan fase diam melekat pada bagian luar bola kecil silika partikel (kecil manik-manik yang sangat). Partikel ini datang dalam berbagai ukuran dengan 5 μ m manik-manik yang paling umum. partikel yang lebih kecil pada umumnya memberikan luas permukaan lebih banyak dan pemisahan lebih baik, tetapi tekanan yang dibutuhkan untuk optimal meningkatkan kecepatan linier dengan kebalikan dari kuadrat diameter partikel. Ini berarti bahwa mengubah untuk partikel yang separuh besar, menjaga ukuran kolom yang sama, akan menggandakan kinerja, tetapi meningkatkan tekanan yang dibutuhkan dengan faktor empat. partikel yang lebih besar digunakan dalam HPLC preparatif (diameter kolom 5 cm sampai dengan> 30 cm) dan untuk aplikasi non-HPLC seperti fase ekstraksi padat .

ukuran pori

fasa diam Banyak berpori untuk memberikan luas permukaan yang lebih besar. Pori-pori kecil memberikan luas permukaan yang lebih besar sedangkan ukuran pori yang lebih besar memiliki kinetika yang lebih baik, terutama untuk analit yang lebih besar. Sebagai contoh, sebuah protein yang hanya sedikit lebih kecil daripada pori mungkin memasuki pori-pori tetapi tidak mudah meninggalkan begitu dalam.

Tekanan Pompa

Pompa bervariasi dalam kapasitas tekanan, tetapi kinerja mereka diukur pada kemampuan mereka untuk menghasilkan konsisten dan reproducible laju aliran . Tekanan dapat mencapai setinggi 40 MPa (6000 lbf / in ² ), atau sekitar 400 atmosfer. Modern HPLC sistem telah diperbaiki untuk bekerja di banyak tekanan yang lebih tinggi, dan oleh karena itu dapat menggunakan partikel ukuran yang lebih kecil banyak kolom (<2 μ m). Ini "Ultra Kromatografi Cair Kinerja Tinggi" sistem atau RSLC / UHPLCs dapat bekerja sampai dengan 100 MPa (15.000 lbf / in ²), atau sekitar 1000 atmosfer. Istilah "UPLC" adalah merek dagang dari Corporation Waters , tetapi kadang-kadang digunakan untuk merujuk pada teknik yang lebih umum.

Skema representasi dari suatu HPLC unit.
(1) Solvent reservoirs, (2) Solvent degasser, (3) Gradient valve, (4) Mixing vessel for delivery of the mobile phase, (5) High-pressure pump, (6) Switching valve in "inject position", (6') Switching valve in "load position", (7) Sample injection loop, (8) Pre-column ( guard column ), (9) Analytical column, (10) Detector (ie IR, UV), (11) Data acquisition, (12) Waste or fraction collector. (1) pelarut reservoir, (2) Solvent degasser, (3) Gradient katup, (4) Kapal Mixing untuk pengiriman dari fase gerak, (5) pompa bertekanan tinggi, (6) katup Switching di "inject posisi", ( 6 'Switching katup) dalam "posisi beban", (7) Contoh injeksi loop, (8) Pra-kolom ( kolom penjaga ), (9) Analitis kolom, (10) Detektor (yaitu IR, UV), (11) Data akuisisi, (12) Sisa atau kolektor fraksi.s

Dari kiri ke kanan: Perangkat pemompaan menghasilkan gradien dari dua pelarut yang berbeda, baja ditegakkan kolom dan aparatus untuk mengukur absorbansi

DAFTAR PUSTAKA

1.      Anonym ,2010.http://en.wikipedia.org/wiki/High-performance_liquid_chromatography

2.  Displacement Chromatography 101. Sachem, Inc. Austin, TX 78737 ^ Pemindahan Kromatografi 101. kepala suku, Inc Austin, TX 78737
3. Lloyd R. Snyder and John W. Dolan ,2006, High-Performance Gradient Elution: The Practical Application of the Linear-Solvent-Strength Model . Sebuah buku baru-baru ini memberikan perawatan yang komprehensif dari teori kinerja gradien kromatografi-tinggi, High-Performance Gradient Elusi Penerapan Praktis dari-Pelarut-Kekuatan Linier. Wiley Interscience. ISBN 0471706469 . Wiley InterScience. ISBN 0471706469 .  
4. Fast and Ultrafast HPLC on sub-2 μm Porous Particles — Where Do We Go From Here Cepat dan ultrafast HPLC pada sub-2 Porous Partikel pM - Mana Kita Pergi Dari Sini?- LC-GC Europe - LC-GC Eropa
5. Xiang, Y.; Liu Y. and Lee ML,2006,"Ultrahigh pressure liquid chromatography using elevated temperature". Journal of Chromatography A 1104 (1-2): 198–202. doi : 10.1016/j.chroma.2005.11.118 ..  
6. Horváth, Cs.; Preiss BA and Lipsky SR (1967). Horvath, Cs). Preiss; BA Lipsky dan SR (1967. "Fast liquid chromatography. Investigation of operating parameters and the separation of nucleotides on pellicular ion exchangers". Analytical Chemistry 39 : 1422–1428. doi : 10.1021/ac60256a003 ..